如何避免磷酸化修饰位点鉴定的“坑”，你知道吗？
景杰学术/报道
磷酸化是一种非常重要的翻译后修饰，在多种生命活动的调控包括生物的生长发育、信号转导以及疾病进程等过程中发挥不可或缺的功能。当下蛋白质组学研究正如火如荼地发展，随着技术的不断成熟，依赖于质谱的蛋白质磷酸化的检测，极大地推动了磷酸化蛋白质组学的发展。
但是我们知道组学中鉴定到的磷酸化位点未必都是真实的，仍然存在一些假阳性。那么我们如何才能拥有“火眼金睛”去识别哪些是可靠的磷酸化位点，哪些是有水分的呢？下面小编就带大家一起来学习“绕坑”技能吧。
在蛋白质组学结果的肽段鉴定中，FDR（false discovery rate，假发现率）是一个重要的标准来帮助大家评价整体匹配结果的正确率。一般通过FDR卡值1%来获取可信度更高的蛋白质组学数据。但是，对于修饰位点的鉴定，仅仅卡值肽段的FDR是不够的。因为除了一个肽段是否发生修饰以外，这个修饰到底位于该肽段的哪一个位点上，同样是一个有些纠结的问题。因此在处理PTM质谱数据时，还很必要对修饰位点进行错误定位率（false localization rate, FLR）的控制。
下面小编就给大家举一个例子，更形象的来说明FLR的概念。比如在磷酸化组学修饰位点鉴定结果列表中，有一个肽段发生了磷酸化修饰：
PSQGLPVIQSPPS(0.103)S(0.897)PAHR
对于质谱来说，区分一个肽段上不同位点、尤其是相邻两个位点的磷酸化，是极具挑战的。因为这些肽段在一级谱图上的质量完全相同，而在二级谱图上也高度类似。例如这个序列的13位或14位发生磷酸化的话，其实只有一个y5离子的质量差别，其余离子都是一模一样的。而面对这样微小的差别，质谱和搜库软件通常难以做明确的区分，这就会导致出现错误定位（false localization）的问题。
图1 肽段位点磷酸化谱图，第13位或14位S的磷酸化发生，只在y5离子的位置上有所区别
1. 不同打分的软件
幸运的是，虽然针对FLR的控制仍是一个挑战，但目前已经有多种评估软件或算法可使用。绝大多数位点定位软件或者算法所采用的策略主要分为两种：一种是试图评估某个给定峰匹配到特定位点的概率，采用这种策略的包括A-Score、PTM Score等；另一种策略是计算两个修饰位点间搜索引擎给出的打分差值，采用这种策略则以Mascot Delta Score等为代表。
2. MaxQuant PTM score 打分系统
MaxQuant是目前最常使用的搜库软件之一，其PTM score打分系统能够实现对FLR的有效控制，主要是基于峰值匹配概率的原理。首先找出定位待评估的两个位点之间的离子，然后分别计算两个修饰位点的离子峰匹配到离子的个数，计算累计二项分布的p值和位点的打分值，最后计算两个修饰位点的打分差值从而判断该肽段的修饰位点。这个软件的特点，是能够给出每一个可能的位点一个分值，而通常认为>0.75的位点是可信的。
讲了这么些理论，有的读者可能会觉得比(ku)较(zao)深(fa)奥(wei)了，下面让小编来展示一个具体的例子。
小编这边的实验室里刚刚完成了一个磷酸化的测试结果，在鉴定到的31611个磷酸化位点中，通过MaxQuant PTM score 系统对Localization Probability卡值0.75，有25581个位点可以被准确定位（localization probability>0.75）。这一步操作直接剔除了约25%可信度低的位点，挤掉磷酸化位点鉴定的“水分”，获取更可靠的磷酸化位点鉴定结果。如果不卡值，那么那些即便是0.1级别的位点也都统统被纳入分析，这些几乎可以肯定是错误的鉴定结果。
图2磷酸化位点定位概率分布（MaxQuant PTM score 系统）
3.文献中的应用
当然，对FLR的严格限制也会导致丢失少量的真实磷酸化鉴定结果，这是任何一种统计方法都无法避免的，但是本着科学上“宁缺毋滥”的原则，对其限定仍然是必要的。在高水平文章的发表中，选择localization Probability>0.75卡值后进行分析也是通行的惯例[2-3]。有的文章中即便没有写明，但是看一下其附件的鉴定列表，也都是进行过卡值的[4-5]。所以大家一定要擦亮眼睛，分析和验证的时候，一定要绕开那些“低分”的位点哦。
全线升级
目前景杰生物的高深度磷酸化体系进行了全面升级，体现在：
1.技术升级：项目平均深度超过10000个位点。
2.质控升级：FDR和FLR双重质控，挤掉1/4的“水分”。
3.生信分析升级：激酶预测、信号通路分析，深度挖掘数据。
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参考文献
1.石文昊,童梦莎,李凯,王钰珅,丁琛, 2018, 45(12):1250-1258. 基于质谱的磷酸化蛋白质组学：富集、检测、鉴定和定量，生物化学与生物物理进展.
2.Francesca Sacco., et al., (2016) Glucose-regulated and drug-perturbed phosphoproteome reveals molecular mechanisms controlling insulin secretion. Nature Communications.
3.Lei-Lei Chen., et al.,(2017) Phosphoproteome-based kinase activity profiling reveals the critical role of MAP2K2 and PLK1 in neuronal autophagy.Autophagy.
4.Liu, J. J., et al., (2018) In vivo brain GPCR signaling elucidated by phosphoproteomics. Science.
5.Tenley C. Archer., etal., (2018) Proteomics, Post-translational Modifications, and Integrative Analyses Reveal Molecular Heterogeneity within Medulloblastoma Subgroups.Cancer Cell.
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